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农杆菌化学感受态细胞 克隆与表达
简要描述:
农杆菌化学感受态细胞 克隆与表达EHA105菌株由EHA101菌株改造而来,染色体背景为C58,核基因含筛选标签—利fu平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105(pTiBo542DT-DNA),此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件 质粒自身的T-DNA转移功能虽被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DN
产品时间:2024-06-25
EHA105(pSoup) Chemically Competent Cell
农杆菌化学感受态细胞
产品标签:
EHA105菌株;农杆菌感受态细胞;Rifampicin(Rif) 利fu平;Kanamycin(kan)卡那mei素;EHA101;LBA4404;GV3101;AGL1;植物转基因研究;
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货号 | 产品名称 | 规格 | 价格(元) |
MF2473-1000UL | EHA105(pSoup) Chemically Competent Cell农杆菌电转感受态细胞 | 10×100μl | 288 |
MF2473-5000UL | EHA105(pSoup) Chemically Competent Cell农杆菌电转感受态细胞 | 50×100μl | 1228 |
产品描述:
EHA105菌株由EHA101菌株改造而来,染色体背景为C58,核基因含筛选标签—利fu平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105(pTiBo542DT-DNA),此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pEHA105(pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能虽被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。在EHA105菌株中转入help质粒:pSoup,即得到:EHA105 (pSoup)菌株,可帮助pGreen,62SK,pGs2系列质粒在农杆菌中复制,同时赋予该菌株四环素(tetR)抗性,适用于水稻、烟草等植物的转基因操作。
我司(懋康生物)提供的EHA105 (pSoup)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作,基因型为C58 (rifR) Ti pEHA105 (pTiBo542DT- DNA) Succinamopine (pSoup-tetR),经pGs2质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
产品组分:
组分编号 | 组分名称 | 货号(规格) | |
MF2473-1000UL | MF2473-5000UL | ||
MF2473-A | EHA105(pSoup)Chemically Competent Cell | 10×100μl | 50×100μl |
MF2473-B | pGs2 Control Vector (10ng/μl) | 10μl | 10μl |
保存与运输条件:
保存:-80℃保存,1年有效。
运输:干冰运输。
注意事项
1) 感受态细胞应保存在-80℃,不可反复冻融和放置时间过长,以免降低感受态细胞的转化效率。
2) 整个转化操作,严格根据相应温度及无菌条件要求进行。
3) 加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
4) 为确保最高转化效率,整个操作过程应尽量轻柔,并保持低温。
5) 转化高浓度的质粒可相应减少最终涂板用量。
6) 平板上克隆密度过大时,由于营养不足,克隆生长变慢,菌落变小。为获得大菌落,应减少质粒用量。
7) 培养基中加入利fu平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链mei素或庆大mei素可防止Ti质粒丢失,但链mei素不利于农杆菌的转基因操作,一般培养农杆菌时不考虑链mei素或庆大mei素,因Ti质粒丢失的概率极低(基本可以忽略)
8) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
1) 取-80℃保存的感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化,达到冰水混合状态时插入冰浴中使其完quan融化。
2) 往100μl感受态细胞悬液中加入0.01~1μg(体积不大于10μl)质粒DNA,用手拨da管底使其混匀,依次于冰上静置5min,液氮5min,37℃水浴5min,冰浴5min。
【注意】:第一次使用,建议做预实验确定所加质粒的用量。
3) 加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基,于28℃振荡培养2-3h。
4) 6,000rpm离心1min,吸掉600ul上清,之后用枪轻轻吹打重悬菌体。之后加到含相应抗生素的LB或YEB平板上,用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min,待液体被吸收后,倒置平板,28℃培养2-3天。
【注意】:当平板只含50μg/ml卡那mei素时,28℃培养48h即可;当平板中同时加入50μg/ml卡那mei素和10μg/ml利fu平时,需28℃培养48-60h;当平板中同时加入50μg/ml卡那mei素和20μg/ml利fu平时,需28℃培养60-72h;不建议使用超过20μg/ml的利fu平用于平板或液体培养。
5)目的克隆的液体培养:
j小量摇菌:往15ml的圆底透气试管中加入1ml含对应抗生素的LB液体培养基,从新鲜培养的平板上挑1-2个单菌落接种,30℃,200rpm摇菌24-48h。
k大量摇菌:100ml透气三角瓶内加入少于20ml含对应抗生素的LB液体培养基,取小摇菌液按2%比例接菌,30℃,200rpm摇菌24-48h。
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附表1固体和液体LB培养基配方
组分Component | LB(液体)/升 | LB(固体)/升 |
胰蛋白胨Tryptone | 10g | 10g |
酵母提取物Yeast extract | 5g | 5g |
氯化钠NaCl | 10g | 10g |
1N NaOH | 调整pH至7.0 | 调整pH至7.0 |
琼脂Agar | / | 15g |
附表2固体和液体YEB培养基配方
组分Component | YEB(液体)/升 | YEB(固体)/升 |
胰蛋白胨Tryptone | 5g | 5g |
酵母提取物Yeast extract | 1g | 1g |
牛肉浸膏Beef Extract | 5g | 5g |
蔗糖Sucrose | 5g | 5g |
七水硫suan镁MgSO4·7H2O | 0.49g | 0.49g |
1N NaOH | 调整pH至7.0 | 调整pH至7.0 |
琼脂Agar | / | 15g |
附表3常见农杆菌对抗生素敏感性总表
农杆菌菌株 | 羧苄(carb) | 链mei素(strep) | 利fu平(rif) | 庆大mei素(gent) | 卡那mei素(kan) |
EHA101 | S | S | R | S | R |
EHA105 | S | S | R | S | S |
LBA4404 | S | R | R | S | S |
GV3101 | S | S | R | R | S |
AGL1 | R | S | R | S | S |
【备注】:S代表敏感,R代表抗性。 |
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】
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